蛋白质多肽检测
蛋白质多肽检测

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·蛋白质检测概述

蛋白质谱技术简◎单来说就是一种将质谱仪用于研究蛋白质的技术。目前,它的基本原理是蛋白质经过蛋白酶的酶切消化后成肽段混合物,在质谱仪中肽段混合物电离形成带电离子,质谱分析器的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值卐(即质荷比,M/Z)的肽段离☉子分离开来,经过检测器收集分离的离子,确定每个离子的M/Z值。经过质量分析器可分析出每个肽█段的M/Z,得到蛋白质所有肽段的M/Z图谱,即蛋∴白质的一级质谱峰图。离子选择装置自动选取强度较大肽段离子进行二级质谱分析,输出选取肽段的二级质谱峰图,通过和理论上蛋白质经过胰蛋白酶消化后产生的一级质谱ξ 峰图和二级质谱峰图进←行比对而鉴定蛋白质。

一开始,蛋白质谱通过※离子化(Electrospray Ionization,ESI)或者基质辅助激光解吸电离(Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization,MALDI)的方法对【完整的蛋白质进行离子化后进入→质谱分析仪器,这也被称为“top-down”蛋白分析方法。后来,完整的蛋白质通过酶切作用↓后,分解成〗多肽混合物,这些混合物进入质谱仪后,通过多肽指纹图谱或串联质谱的方法进行鉴定,这被称为'bottom-up'方法。显然,后者可以从多肽水平实现对蛋白质的分析和鉴定。
蛋白质多肽检测

蛋白质★检测的其他方法

1、凯氏定氮法

这种■方法是1883年Kjeldahl发明,当时凯氏︾只使用H2SO4来分解试样,来定量谷物中的pro,他只知用H2SO4分解试样,而不能」阐明H2SO4分解有机氮化合物生成氨的反应历程,所以只使用H2SO4分解试样,需要较长时】间,后来由Gunning加入改进,他改进█的办法是在消化时加入K2SO4使沸点上升,这样加快分解速度,因为温度由原来硫酸沸△点的380上升到400℃,提高▓了不到67℃所以速度也就加快了,凯氏定氮法至今仍在使用。我们在检验食品中pro时,往往只限于测定总←氮量,然后乘以pro核算等数,得到蛋白质含量,实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物,故称为粗pro。

2、水扬酸比色法

原理: 样品中的pro经H2SO4消化转化为铵盐溶液后,在一定的酸度和温度下与水扬酸钠和次氯酸钠作用ζ生成有颜色的化合物,可以在波长660nm处比色测定,求√出样品含氮量,计算蛋白质含量。

3、紫外分光光度法

原理:pro及其降解产物的芳香环基 ,在』紫外区内对某一波长具有一定的光选择吸收,在280nm下,光吸收与pro浓度(3~8mg/ml)成直线关系,因此,通过测定pro溶液的吸■光度,并参照事先用K氏【定氮法分析的标准样品,从标准曲线查出蛋白质的含量。

4、双缩脲法-皮尼克法

原理:双缩脲在碱性条件中,能与CuSO4结合成红紫色的」络合物。pro分子中含有肽链与双缩脲结构相似,也呈此反应。本法直接用于测定像小麦粉等固体试样的pro含量。但作为铜的稳定剂,酒石酸钾钠比甘油好些。小麦粉中的pro能直接地一边抽出一边进行定量。


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